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細胞培養(yǎng)的過程和注意事項
   細胞培養(yǎng)的過程和注意事項
  細胞培養(yǎng)一般過程
  一、準備工作
  準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要,工作量也較大,應給予足夠的重視,準備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調試,具體內容可參閱有關文獻。
  二、取材
  在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養(yǎng)器皿中,這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養(yǎng),實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養(yǎng),分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng),腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應立即處理,盡快培養(yǎng),因故不能馬上培養(yǎng)時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應嚴格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理。由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。
  三、培養(yǎng)
  將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng),則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng),一般應在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù),按要求以一定的量(以每毫升細胞數(shù)表示)接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后,立即放入培養(yǎng)箱中,使細胞盡早進入生長狀態(tài)。正在培養(yǎng)中的細胞應每隔一定時間觀察一次,觀察的內容包括細胞是否生長良好,形態(tài)是否正常,有無污染,培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。一般原代培養(yǎng)進入培養(yǎng)后有一段潛伏期(數(shù)小時到數(shù)十天不等),在潛伏期細胞一般不分裂,但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng),將一瓶中的細胞消化懸浮后分兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為"一代"。二倍體細胞一般只能傳幾十代,而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質,也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。培養(yǎng)正在生長中的細胞是進行各種生物醫(yī)學實驗的良好材料。
  四、凍存及復蘇
  為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度--196℃,將細胞收集凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養(yǎng)基,以一定的冷卻速度凍存,終保存于液氮中。在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
  細胞培養(yǎng)注意事項
  1、實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌,以70%乙醇擦拭無菌操作臺面,并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以70%ethanol擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后,再進行下一個細胞株的操作。
  2、無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域,勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
  3、小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
  4、工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(少ClassⅡ)。操作過程中,應避免引起aerosol之產生,小心毒性藥品,例如DMSO及TPA等,并避免尖銳針頭之傷害等。
  5、定期檢測下列項目:5.1CO2鋼瓶之CO2壓力5.2CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。5.3.無菌操作臺內之airflow壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000小時/HEPA)。6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750),定期更換水槽的水
  6、粉末培養(yǎng)基配制好后(加了血清),一般在4度盡量不要超過1個月,如在-20度存放時間可長一些,但好也不要超過3-4個月,可能對于永生化細胞株來說要求不是太高,細胞嬌弱,放置時間不宜過長。
  7、開紫外線照射臺的時候,就將培養(yǎng)基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后,溫度也升上來了。有很多人將其放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛(wèi)生,有的常年不清洗,里面很臟,容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用時也一定要勤換水。從水浴鍋拿出后,好找個毛巾擦干上面的水。

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